Sei modi per "uccidere" i virus: qual è il migliore per il nuovo coronavirus?

In questo articolo vengono riassunti diversi metodi per inattivare i virus e i relativi principi di inattivazione, in modo che chiunque possa trovare il metodo di disinfezione più adatto in base a ciò. Allo stesso tempo, vedremo anche che potrebbe esserci più spazio per lo sviluppo del vaccino inattivato contro il COVID-19.

Scritto da Peng Cheng (dottorando nel laboratorio di Li Sai presso l'Università di Tsinghua), Li Sai (ricercatore presso l'Advanced Innovation Center for Structural Biology dell'Università di Tsinghua)

La storia dello sviluppo umano è anche la storia della lotta contro i virus. Ripensando alla storia, i virus hanno sferrato innumerevoli attacchi feroci contro gli esseri umani. Si stima che il virus del vaiolo sia apparso più di 10.000 anni fa e sia stato diffuso in tutto il mondo fino al 1980. Il vaiolo ha un alto tasso di mortalità, causando circa 300 milioni di morti in tutto il mondo solo nel XX secolo[1]. I virus dell’influenza hanno causato danni in tutto il mondo molte volte negli ultimi 100 anni, con la sola influenza spagnola del 1918 che ha causato decine di milioni di vittime[2]. Inoltre, il virus dell'immunodeficienza umana (comunemente noto come "HIV"), il virus Ebola e il virus dell'epatite stanno ancora prendendo di mira gli esseri umani e l'attuale nuovo coronavirus continua a mostrare forti caratteristiche di trasmissione grazie alla continua emergenza dei suoi ceppi mutanti. Finora, il numero dei decessi causati da questa nuova epidemia di coronavirus è salito al terzo posto tra tutti i decessi causati da epidemie virali nella storia dell'umanità (da Wikipedia). Di fronte a questo nemico invisibile, gli esseri umani sembrano piuttosto passivi. Non possiamo prendere l'iniziativa di "uccidere" il virus?

Infatti, prima che gli esseri umani conoscessero i virus, avevano già scoperto alcuni modi per "ucciderli", procedendo a tentoni. Anche l'antica medicina cinese ne ha traccia e alcuni metodi hanno ancora oggi un significato scientifico guida. Ad esempio, ciò che Li Shizhen ha scritto nel "Compendio di Materia Medica" è che "quando c'è un'epidemia, bisogna togliere i vestiti del paziente e vaporizzarli in una vaporiera, così l'intera famiglia non verrà infettata". Questo è un esempio dell'uso delle alte temperature per "uccidere" i virus. Con il progresso della biologia, della fisica, della medicina moderna e della chimica, la concezione umana dei virus è cambiata: da "spirito maligno" e "punizione divina" a "minuscola particella biologica specializzata nel parassitismo", il che fornisce anche una base biologica per lo sviluppo di mezzi per "uccidere" i virus.

Oggigiorno le persone hanno a disposizione diversi modi per "uccidere" i virus. Alcuni possono distruggere la struttura del virus e "ucciderlo" rapidamente, come l'alcol (distruggendo la capsula) e le alte temperature (denaturazione delle proteine). Si tratta di metodi di disinfezione comuni. Alcuni metodi possono preservare l'immunogenicità o l'integrità strutturale del virus "uccidendolo", come la formaldeide (fissazione delle proteine) e la β-propiolattone (distruzione dell'acido nucleico). Una volta che il virus è stato "ucciso", viene spesso utilizzato per preparare vaccini o per ricerche sulla biologia strutturale del virus.

Come possiamo “uccidere” il virus?

In realtà l'espressione "uccidere il virus" non è corretta. I virus possono essere descritti come uno degli organismi progettati dalla natura con uno stile "minimalista". La loro struttura è così semplice che sono costituiti solo da acidi nucleici avvolti in membrane proteiche/lipidiche. All'esterno del corpo non può replicarsi, non consuma energia e non sintetizza o decompone sostanze. Sembra essere in uno stato "morto". Tuttavia, una volta invasa una cellula, può trasformarla in una vera e propria fabbrica di produzione e riprodurre altre particelle virali. Pertanto non esiste una risposta univoca alla domanda se i virus siano vivi. L'"uccisione" di cui si parla nell'articolo precedente in realtà significa far perdere al virus la sua capacità di riprodursi, cioè impedirgli di "tornare in vita" anche se incontra un ospite. In vitro, questo processo è noto nella comunità virologica come "inattivazione".

Se si vuole bloccare la riproduzione del virus, bisogna prima comprenderne il ciclo di vita. Le particelle virali utilizzano le proteine ​​presenti sulla loro superficie come "chiavi" per identificare l'ospite ed entrare nella cellula, utilizzando le materie prime e l'energia della cellula per replicare i propri genomi e sintetizzare le proprie proteine. Questi genomi e proteine ​​strutturali appena sintetizzati vengono assemblati in particelle virali di progenie e rilasciati all'esterno della cellula. Per quanto riguarda le attività vitali del virus, ci sono generalmente tre modi per inattivarlo. Uno è quello di distruggere la struttura complessiva del virus o la sua struttura proteica, in modo che perda la capacità di invadere le cellule. L'altro metodo è quello di "bloccare" la proteina del virus in modo che non possa funzionare. L'ultima consiste nel distruggere il genoma del virus in modo che non possa replicarsi nella cellula.

Il ciclo di vita del nuovo coronavirus e del virus dell’influenza[3].

Il ciclo di vita del nuovo coronavirus (a sinistra) e del virus dell'influenza (a destra) segue le seguenti fasi:

①Entra nella cella. Le proteine ​​di superficie delle particelle virali riconoscono i recettori, si verifica la fusione della membrana e il materiale genetico viene rilasciato;

②Replicazione del genoma. Il nuovo coronavirus induce le cellule a produrre vescicole a doppia membrana (DMV)[4] come sito per la replicazione del suo genoma, mentre i virus dell’influenza replicano il loro genoma nel nucleo cellulare;

③Traduzione delle proteine ​​virali;

④ Assemblaggio e gemmazione delle particelle virali. L'assemblaggio del nuovo coronavirus avviene nell'intermedio del reticolo endoplasmatico-Golgi (ERGIC), mentre il virus dell'influenza si assembla sulla membrana cellulare;

⑤ Rilascio di virus di progenie.

Sulla base delle idee sopra esposte sono nati vari metodi di inattivazione del virus. A seconda del metodo di inattivazione, si può distinguere l'inattivazione chimica e l'inattivazione fisica. Diversi metodi di inattivazione hanno effetti diversi sul virus. Alcuni metodi riescono a inattivare rapidamente il virus, mentre altri riescono a preservare la struttura proteica o l'immunogenicità del virus durante l'inattivazione. Gli scienziati stanno inoltre conducendo ricerche scientifiche a valle basate su diversi metodi di inattivazione, come l'istituzione di metodi di disinfezione rapida, l'analisi strutturale del virus e lo sviluppo di vaccini inattivati. In questo articolo verranno brevemente introdotti alcuni dei principali metodi e principi di inattivazione dei virus.

Inattivazione chimica

formaldeide

Tutti dovrebbero conoscere la formaldeide. La sua soluzione acquosa è la famosa formalina, che è un conservante e fissativo. La formaldeide contiene un atomo di carbonio centrale con un elettrone mancante ed è elettrofila, quindi può subire reazioni di addizione nucleofila con nucleofili. Può monoidrossilare il gruppo amminico all'estremità azotata della proteina e gli amminoacidi contenenti azoto nella catena laterale (come lisina, arginina, tirosina, ecc.) e disidratarsi ulteriormente per formare intermedi imminici, che possono reagire nuovamente con i residui di arginina e tirosina per formare ponti metilenici e reticolazioni. Inoltre, la formaldeide può anche monoidrossilare l'adenina, impedendo la lettura dei geni[5]. Pertanto, la formaldeide può non solo infliggere un doppio colpo alle proteine ​​e al genoma del virus, ma anche fissare la struttura delle proteine ​​virali attraverso il cross-linking. Poiché la formaldeide può “bloccare” le strutture proteiche, l’inattivazione della formaldeide non è solo un candidato importante per lo sviluppo di vaccini inattivati, ma anche un metodo comune di inattivazione del virus utilizzato dai biologi strutturali nell’analisi delle strutture virali[6].

Principio della reazione della formaldeide con adenina e lisina[5]

β-propiolattone

Il β-propiolattone è un agente alchilante che agisce principalmente sulla guanina ed è anche considerato un agente inattivante che tende a danneggiare gli acidi nucleici. Il β-propiolattone elettrofilo può subire una reazione di sostituzione nucleofila con la guanina, con conseguente apertura dell'anello del β-propiolattone e alchilazione della guanina, portando all'inattivazione del genoma virale[5]. Attualmente, il β-propiolattone è l'agente inattivante più ampiamente utilizzato nello sviluppo di vaccini inattivati, ma studi hanno dimostrato che il β-propiolattone può anche modificare alcuni amminoacidi, determinando reazioni di acilazione e reticolazione[7].

Principio della reazione tra β-propiolattone e guanina[5]

Etanolo

L'etanolo è alcol. L'etanolo inattiva molto rapidamente i virus, in particolare quelli con involucro. I virus con involucro sono un tipo di virus circondati da un doppio strato lipidico. Poiché l'etanolo è sia lipidico che idrofilo, può aumentare l'affinità della membrana per l'acqua riducendo al contempo l'interazione tra residui di amminoacidi non polari, distruggendo così la struttura complessiva del virus e denaturando le proteine ​​virali[8].

Nel 2021, Das et al. hanno descritto l'effetto distruttivo dell'etanolo sui virus con involucro attraverso la simulazione della dinamica molecolare. Dopo che il virus veniva immerso in una soluzione di etanolo al 75%, il suo involucro si disintegrava e rilasciava il suo contenuto[9]. Anche il nuovo coronavirus è un virus dotato di involucro. Nel 2020, Annika Kratzel ha scoperto attraverso esperimenti che l'infettività del nuovo coronavirus può essere ridotta al livello di base dopo essere stati immersi in una soluzione con un contenuto di alcol superiore al 30% per 30 secondi[10]. Oltre all'etanolo, anche molti altri composti alcolici possono mostrare una velocità di inattivazione più rapida, come l'n-propanolo e l'isopropanolo[10]. Poiché questi composti presentano le caratteristiche di rapida inattivazione e bassa tossicità, vengono spesso utilizzati come ingredienti principali di disinfettanti per le mani e per le superfici degli oggetti.

Schema del meccanismo con cui i composti alcolici distruggono il nuovo coronavirus[8]

Inattivazione fisica

temperatura

Anche l'alta temperatura è un metodo di inattivazione comune e comunemente utilizzato. Sotto l'effetto delle alte temperature, i legami chimici che mantengono le strutture secondarie e terziarie delle proteine ​​virali vengono distrutti, causando la denaturazione delle proteine ​​e facendo perdere al virus la capacità di infettare le cellule e di replicarsi. Didac Martí et al. dell'Università Politecnica della Catalogna hanno utilizzato simulazioni di dinamica molecolare per scoprire che le alte temperature possono causare cambiamenti strutturali e riarrangiamenti dei legami idrogeno nelle proteine ​​sulla superficie del nuovo coronavirus, in particolare nelle regioni di legame del recettore delle proteine ​​di superficie [11]. Inoltre, le alte temperature possono anche rompere la struttura portante degli acidi nucleici.

Vale la pena ricordare che attualmente si ritiene che una temperatura “bassa” (inferiore a 41°C) possa causare la rottura del genoma virale senza influenzare la struttura e la funzione delle proteine[5]. Nel 2020, Christophe Batéjat dell’Istituto Pasteur ha sottoposto campioni di tamponi nasofaringei del nuovo coronavirus a trattamenti ad alta temperatura di 56°C, 65°C e 95°C e ha scoperto che il nuovo coronavirus sarebbe stato inattivato rispettivamente dopo 20 minuti, 10 minuti e 3 minuti[12]. L'inattivazione ad alta temperatura è oggi una fase necessaria nel trattamento dei rifiuti biosicuri, grazie ai suoi effetti stabili e ad ampio spettro.

Luce ultravioletta

La luce ultravioletta è una luce invisibile con una frequenza più alta della luce blu-violetta. Secondo gli standard dell'Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione (ISO), la luce ultravioletta può essere ulteriormente suddivisa in banda UVA (320-400 nm), banda UVB (280-320 nm) e banda UVC (200-280 nm) in base alla sua lunghezza d'onda. Tra questi, l'UVC è il più distruttivo per i virus, seguito da UVB e UVA[13], quindi l'UVC è anche la banda principale utilizzata per inattivare i virus.

Il modo principale in cui la luce ultravioletta distrugge gli acidi nucleici virali è inducendo la formazione di dimeri di pirimidina all'interno dell'acido nucleico. Quando la luce ultravioletta viene assorbita dall'acido nucleico del virus, due pirimidine adiacenti o opposte nel genoma virale subiscono una fusione fotochimica per formare un dimero di pirimidina legato covalentemente. A causa delle interazioni covalenti, i dimeri di pirimidina introducono tensione nello scheletro del genoma, causandone la rottura[5]. Per alcuni virus, la luce UV può inattivare completamente il virus mantenendone l'attività di fusione[14]. Per il nuovo coronavirus, 9 minuti di irradiazione UVC (dose cumulativa 1048 mJ/cm2) possono inattivare completamente il nuovo coronavirus con un titolo di infezione elevato (5 * 106 TCID50/mL)[13]. Sebbene i raggi UVC abbiano un buon effetto di inattivazione, la loro capacità di penetrazione è scarsa. Il normale vetro trasparente, i vestiti, la plastica, ecc. possono bloccare la maggior parte dei raggi UVC. Per questo motivo, la luce UVC viene spesso utilizzata per disinfettare le superfici di strumenti e oggetti, nonché gli spazi interni di ospedali e laboratori con standard di sicurezza biologica.

Diagramma schematico della formazione di dimeri di pirimidina da parte di uracili adiacenti sotto irradiazione con luce ultravioletta[5]

Radiazioni ionizzanti

Le radiazioni ionizzanti sono energie in grado di provocare la ionizzazione degli atomi o delle molecole della materia. Le tre principali tecniche di radiazioni ionizzanti sono la radiazione gamma, il fascio di elettroni e i raggi X. I raggi gamma sono raggi emessi quando gli atomi decadono e si rompono. Un fascio di elettroni (eBeam) è un fascio di elettroni ad alta energia generato da un acceleratore di fasci di elettroni. I raggi X sono raggi prodotti dalla transizione o dalla stimolazione di elettroni esterni al nucleo[15]. Sebbene le fonti siano diverse, i meccanismi di inattivazione del virus sono fondamentalmente simili.

Gli effetti distruttivi delle radiazioni ionizzanti sui virus possono essere suddivisi in effetti diretti e indiretti. Le radiazioni ionizzanti possono rompere direttamente i legami chimici delle molecole del virus e possono anche ionizzare le molecole d'acqua. La radiolisi delle molecole d'acqua produce una varietà di radicali liberi altamente reattivi. Sebbene questi radicali liberi esistano per un tempo molto breve, possono reagire con le proteine ​​e gli acidi nucleici circostanti, causando gravi danni e indirettamente danneggiando il virus[15]. Tuttavia, alcuni ritengono che le radiazioni ionizzanti attacchino principalmente il genoma virale piuttosto che le proteine[16]. L'effetto di inattivazione delle radiazioni ionizzanti è correlato alla dose di radiazioni e varia notevolmente tra i diversi virus[16]. Con l'aggiornamento e il progresso della tecnologia delle fonti di emissione, la tecnologia di inattivazione delle radiazioni ionizzanti ha iniziato a essere utilizzata anche nella ricerca e nello sviluppo di vaccini, nella disinfezione degli imballaggi della catena del freddo nei paesi importatori e in altri settori.

Un virus inattivato è un vaccino inattivato?

Quando si parla di inattivazione del virus, non si può naturalmente tralasciare l'argomento dei vaccini inattivati. Il ruolo dei vaccini è quello di consentire al nostro organismo di acquisire un'immunità adattativa specifica per un antigene. Grazie all'ausilio degli adiuvanti, l'immunogenicità specifica del vaccino consente di stabilire una memoria immunitaria specifica. Quando lo stesso agente patogeno invade nuovamente, il corpo può attivare rapidamente il sistema immunitario corrispondente ed eliminare rapidamente l'agente patogeno[17]. Nella creazione della memoria immunitaria mediata dal vaccino, l'immunogenicità del vaccino gioca un ruolo fondamentale e i vaccini inattivati ​​non fanno eccezione.

Sebbene i virus inattivati ​​presentino un certo grado di sicurezza, non tutti i virus inattivati ​​presentano comunque la corretta immunogenicità. Da una prospettiva molecolare, il mantenimento dell'immunogenicità significa il mantenimento dell'integrità e della completezza delle proteine ​​di superficie virali. Come si può vedere da quanto sopra, il processo di inattivazione del virus influirà inevitabilmente sulla struttura proteica. Pertanto, è necessario trovare un equilibrio nel processo di sviluppo del vaccino inattivato, ovvero aumentare il più possibile l'immunogenicità del virus garantendo al contempo un'inattivazione stabile e completa del virus. Fin dall'inizio del secolo scorso, gli scienziati hanno cercato costantemente di preparare vaccini immunogenici inattivati ​​utilizzando diversi metodi. Molti di questi vaccini sono già disponibili e diffusi, tra cui il vaccino contro il virus della poliomielite, il vaccino contro il virus dell'epatite A e il vaccino contro la rabbia.

Attualmente, il metodo di inattivazione dei vaccini inattivati ​​si avvale ancora principalmente di reagenti chimici e il processo di preparazione è più o meno il seguente: amplificazione del virus - inattivazione del virus - detossificazione del reagente chimico - purificazione del virus - aggiunta di adiuvanti - imbottigliamento. Sebbene il processo sembri relativamente tradizionale, durante il processo di ricerca e sviluppo ci sono ancora diverse difficoltà importanti da risolvere:

1. Prima di preparare il vaccino, è necessario ottenere un ceppo di semi stabile con un buon effetto immunitario;

2. È necessario selezionare agenti inattivanti, dosaggi e metodi di trattamento appropriati per garantire l'immunogenicità del vaccino;

3. Il virus inattivato deve essere purificato secondo standard elevati;

4. Per supportare una produzione di massa rapida su larga scala è necessario un elevato livello di competenza industriale.

Questi fattori fanno sì che in genere occorrano circa 10 anni affinché un vaccino passi dallo sviluppo alla commercializzazione. Tuttavia, grazie ai progressi della ricerca scientifica e dei livelli tecnologici, nonché all'urgenza del tempo, il vaccino inattivato sviluppato e commercializzato in modo indipendente dal mio Paese ha ottenuto l'autorizzazione all'uso di emergenza dall'Organizzazione Mondiale della Sanità in meno di un anno e mezzo dall'isolamento del primo ceppo del nuovo coronavirus.

Rispetto ad altri vaccini, i vaccini inattivati ​​presentano i vantaggi di un ciclo di ricerca e sviluppo breve, di una tecnologia relativamente matura, di una sicurezza più garantita e di una facile conservazione e trasporto. Tuttavia, anche i vaccini inattivati ​​presentano alcuni punti deboli. Ad esempio, per rispondere alle epidemie di rapide mutazioni dei patogeni, è spesso necessario aggiornare i vaccini contro i ceppi mutati. La velocità di aggiornamento dei vaccini a base di acido nucleico potrebbe essere più rapida di quella dei vaccini inattivati. Inoltre, per alcuni virus con scarsa stabilità antigenica, i metodi di inattivazione tradizionali danneggeranno inevitabilmente l'immunogenicità. Uno studio ha scoperto che dopo che il nuovo coronavirus è stato incubato in β-propiolattone allo 0,05% a 4°C per 36 ore, il 74% della conformazione proteica sulla sua superficie non aveva più la corretta immunogenicità[18]. Ciò dimostra indirettamente anche che esiste ancora un grande potenziale per lo sviluppo di vaccini inattivati.

La struttura del nuovo coronavirus inattivato da paraformaldeide[6] e β-propiolattone[18] e micrografie elettroniche dell'espressione dell'antigene indotta dal vaccino adenovirus sulla superficie cellulare[19].

Figure A e B: Rispetto al virus dopo la fissazione con paraformaldeide, l'inattivazione del β-propiolattone può causare un enorme cambiamento conformazionale nella proteina spike, da un triangolo invertito (blu nel grafico a torta) a una lunga colonna (arancione nel grafico a torta). Tuttavia, non si può escludere che questo drastico cambiamento si sia verificato durante la purificazione del virus, perché la proteina spike dopo il trattamento con β-propiolattone presenta un grado di libertà maggiore rispetto a quello dopo il trattamento con formaldeide. Ciò non significa tuttavia che il virus inattivato con formaldeide abbia una maggiore immunogenicità. Studi hanno dimostrato che la fissazione della formaldeide può ridurre l'esposizione della regione di legame del recettore sulla proteina spike, che a sua volta influenza l'induzione delle risposte immunitarie[20].

Figura C: Un tipo di vaccino con acido nucleico (il vaccino adenovirus) può indurre direttamente le cellule ospiti a esprimere antigeni e stimolare la risposta immunitaria dell'organismo. Gli antigeni introdotti con questo metodo non verranno danneggiati dal mondo esterno. L'immagine mostra che un gran numero di antigeni viene espresso sulla superficie delle cellule dopo la vaccinazione con il vaccino adenovirus.

Veduta

L'inattivazione è la nostra arma preventiva contro i virus. Oltre alla disinfezione diretta, possiamo anche utilizzare virus inattivati ​​per creare una barriera immunitaria. L'obiettivo del miglioramento del processo di preparazione dei vaccini con virus inattivati ​​è trovare un metodo di inattivazione che distrugga solo gli acidi nucleici senza modificare la struttura dell'antigene, abbia costi contenuti, un'elevata produttività e sia atossico. Attualmente, anche diversi metodi di inattivazione fisica mostrano un grande potenziale nello sviluppo di vaccini e, sotto alcuni aspetti, presentano persino dei vantaggi. In primo luogo, l'inattivazione fisica non introdurrà nuova tossicità e può eliminare l'operazione di detossificazione durante la preparazione; Inoltre, l'inattivazione fisica ha un ampio spettro ed è maggiormente applicabile a diversi tipi di virus o a virus che possono mutare rapidamente. Inoltre, l'inattivazione fisica ha il potenziale di ricerca e sviluppo per mantenere una buona immunogenicità, avere bassi costi di preparazione e un'elevata produttività. Esistono già esempi di utilizzo delle radiazioni ionizzanti per sviluppare vaccini inattivati, come il virus dell’influenza inattivato dai raggi gamma[15] e il virus della poliomielite[21], che hanno mostrato un certo potenziale di sviluppo.

Con il continuo accumulo di teorie immunologiche e la continua maturazione di varie tecnologie di inattivazione, credo che nel prossimo futuro gli esseri umani saranno in grado di rispondere immediatamente quando si trovano ad affrontare un'epidemia e saranno in grado di disinfettare e preparare rapidamente i vaccini, combattere attivamente e prevenire la diffusione e la trasmissione del virus.

Riferimenti

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[16] Abolaban, FA e FM Djouider, Inattivazione mediata da irradiazione gamma di virus con involucro con conservazione dell'integrità del genoma: potenziale applicazione per lo sviluppo di vaccini inattivati ​​contro SARS-CoV-2. Open Life Sci, 2021. 16(1): p. 558-570.

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[18] Liu, C., et al., L'architettura del SARS-CoV-2 inattivato con picchi post-fusione rivelata da Cryo-EM e Cryo-ET. Struttura, 2020. 28(11): p. 1218-1224 e4.

[19] Watanabe, Y., et al., Glicoproteina Spike SARS-CoV-2 di tipo nativo espressa dal vaccino ChAdOx1 nCoV-19/AZD1222. ACS Cent Sci, 2021. 7(4): p. 594-602.

[20] Bewley, KR, et al., Risultati immunologici e patologici della sfida SARS-CoV-2 a seguito di vaccino inattivato con formalina in furetti e macachi rhesus. Sci Adv, 2021. 7(37): p. Italiano:

[21] Tobin, GJ, et al., Un nuovo vaccino antipolio a base di sabin inattivato con radiazioni gamma. PLoS One, 2020. 15(1): p. e0228006.

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